 來源：腐敗產(chǎn)品之鋁箔包保久乳來自A廠，調(diào)味乳來自B廠。

 

 腐敗包內(nèi)容物直接鏡檢

 

　　腐敗包經(jīng)搖動(dòng)混合后，以75% 酒精擦拭包裝盒頂，在無菌操作箱中以U. V. 照射表面，按鄭等（1997）之方法，將異常品取內(nèi)容物1 ml，在5 ml無菌水中稀釋，于位相差顯微鏡（OPTIPHOT-2, Nikon）觀察腐敗菌之形態(tài)，并記錄腐敗產(chǎn)品之特性，如pH值、口味。

 

 腐敗產(chǎn)品之取樣培養(yǎng)與微生物分離

 

　　以無菌操作法使用無菌吸管吸取0. 2 ml之內(nèi)容物至nutrient agar（Difco）表面涂抹，在35 ℃培養(yǎng)三天，由nutrient agar之平板上挑出五個(gè)菌落，于位相差顯微鏡下觀察是否與直接鏡檢腐敗內(nèi)容物具有相同細(xì)胞形態(tài)與菌相。若具運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏陽性，并產(chǎn)生孢子，符合這些條件之菌落，再以API（Analytab Products Inc. ）公司之API 50CHB和API 20E快速檢測套組（Logan and Berkeley, 1984），在35 ℃，48小時(shí)培養(yǎng)后，觀察呈色反應(yīng)，將結(jié)果輸入ATB（Automatic Tests in Bacteriology）自動(dòng)判讀系統(tǒng)，鑑定其種名。

 

　

 

二. 孢子懸浮液之制備

 

 一般處理：由腐敗保久乳分離鑑定后之菌株B. cereus TP-5以nutrient broth培養(yǎng)隔夜，取0.1 ml涂抹于含10 ppm MnCl2?4H2O之nutrient agar的平板內(nèi)（Kim and Naylor, 1966），于35 ℃ 培養(yǎng)4天，在位相差顯微鏡下觀察，孢子完全成熟后再加入無菌水將培養(yǎng)基表面的孢子用涂抹棒將其刮起放入試管中，再用無菌水清洗三次（8000X，離心10分鐘），做成孢子懸浮液，然后于85 ℃ 熱水中加熱12分鐘，以殺死營養(yǎng)細(xì)胞，并于4 ℃ 冷藏之（Rajkowski and Mikolajcik, 1987）。

 

　

 

 特殊處理：按Gaze et al.（1990）增加細(xì)菌孢子之耐熱性之方法，將分離株B. cereus TP-5涂抹于產(chǎn)孢之培養(yǎng)基（7.5 g之nutrient agar，含10 ppm MnCl2?4H2O, 0.8 ml之100 ppm（w/v）之CaCl2 和2.2 M sucrose，溶于300 ml蒸餾水），40 ℃ 培養(yǎng)5天，在位相差顯微鏡下觀察，孢子完全成熟后，用2.2 M sucrose溶液收集，做成孢子懸浮液，然后于85 ℃ 熱水中加熱12分鐘，迅速冷卻后，儲存于4 ℃ 備用。

 

　

 

三. 孢子耐性測試

 

　　按Russell（1982）之方法將前項(xiàng)已收集好的孢子以0. 067 M磷酸緩衝溶液（phosphate buffer solution）稀釋，使每ml約含106個(gè)孢子，各裝2 ml孢子懸浮液于TDT試管（thermal death time tube），并以火焰封管后，置于恒溫油槽中（NESLab, Exacal, EX-251 HT, USA），同一個(gè)溫度五種不同的加熱時(shí)間，各取6支試管測試其100 ℃、105 ℃ 和110 ℃ 之孢子耐熱性，加熱完畢后立即放入冰浴槽中冷卻，再以鉆石玻璃刀將TDT試管開口打破，孢子懸浮液倒入殺菌過的nutrient broth，并按Ashton（1971）之方法添加0.1% soluble starch（Difco）以增加受傷孢子之回收，在35 ℃ 培養(yǎng)二天，觀察試管中微生物有無生長。D值計(jì)算根據(jù)Stumbo ( 1973a ) 之方法如下：

 

D＝ t /（log a－log b）

 

t：加熱時(shí)間

 

a：最初細(xì)菌孢子數(shù)

 

b：殘存細(xì)菌孢子數(shù)

 

　　6支試管全部生長時(shí)，則視為每支試管至少有一個(gè)以上孢子未被殺死；只有部份生長，部份未生長時(shí)，視為有生長的為各由一個(gè)殘存孢子生長所致，D值為殺菌孢子數(shù)90% 所需之時(shí)間，Z值為細(xì)菌孢子之D值降低90% 時(shí)所需溫度之差距，亦即細(xì)菌孢子死滅速度D值之溫度系數(shù)。

 

　

 

四. UHT對于B. cereus 孢子之殺菌效果

 

　　將B. cereus TP-5之孢子懸浮液接種至還原乳300 L，使每ml之還原乳中含105～106個(gè)之孢子，經(jīng)由板式熱交換機(jī)（Sterilab, Vtis, Alfa Laval, Sweden）之加熱135 ℃ 或140 ℃，4秒后，以TBA 3充填機(jī)（Tetra Pak, Sweden）包裝后產(chǎn)品經(jīng)37 ℃ 保溫14天后，檢測其包裝外觀和內(nèi)容物所產(chǎn)生之腐敗現(xiàn)象。

 

　

 

五. CIP清洗與蒸汽預(yù)殺菌對于B. cereus孢子之殺菌

 

　　將B. cereus TP-5之孢子懸浮液加入300 L之還原乳，使還原乳之孢子數(shù)105 spores/ml，于板式熱交換、無菌管路和無菌桶中循環(huán)1小時(shí)后再以CIP清洗，以熱水、堿液、熱水、酸液、熱水之順序清洗，先以熱水沖洗5分鐘，再以1.5% NaOH堿液，80 ℃ 清洗30分鐘，熱水沖洗后再以1% HNO3，65 ℃ 清洗25分鐘，最后以50 ℃ 熱水沖洗；隔天生產(chǎn)前，再使用蒸汽殺菌管路，蒸汽維持在121℃，30分鐘。蒸汽殺菌后，將無菌桶之閥組與板式熱交換機(jī)之板片拆卸，以棉花棒涂抹法，按Sveum et al. ( 1992 ) 之方法取板片上有乳垢之處，依CNS 12540仙人掌桿菌之MPN檢測法檢測，正反應(yīng)之試管按Holbrook and Anderson（1980）之方法，涂抹至PEMBA（polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue agar）（bactopeptone, 0.1%; D-mannitol 1%; MgSO4．7H2O 0.01%; NaCl 0.2%; Na2HPO4 0.25%; KH2PO4 0. 025%; bromothymol blue 0. 012%; agar 1.5 %; pH 7. 2±0. 2）。polymyxin最終濃度為100 unit/ml，培養(yǎng)在35 ℃，48小時(shí)，典型菌落為圓鋸齒狀，綠色菌落之透明外環(huán)。由PEMBA之每個(gè)平板上挑出三個(gè)典型菌落，并在位相差顯微鏡下觀察是否是產(chǎn)孢桿菌，具運(yùn)動(dòng)性，并且好氣和厭氣下都能生長，符合這些條件的菌落，再以API 50CHB和API 20E快速檢測套組，在35 ℃，48小時(shí)培養(yǎng)后觀察呈色反應(yīng)，將結(jié)果輸入ATB自動(dòng)判讀系統(tǒng)，鑑定種名，以確定其是否為B. cereus。